熒光素（英語(yǔ)：Fluorescein，又稱為熒光黃）是一種合成有機(jī)化合物，它是具有光致熒光特性的染料，外觀為暗橙色/紅色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在藍(lán)光或紫外線照射下，發(fā)出綠色熒光。熒光染料種類很多，目前常用于標(biāo)記抗體的熒光素有以下幾種：異硫氰酸熒光素，四乙基羅丹明，四甲基異硫氰酸羅丹明，酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。目前熒光素廣發(fā)應(yīng)用在免疫熒光、免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)中。
下面介紹幾種常用熒光素及其基本生物學(xué)特性：
1、異硫氰酸熒光素，簡(jiǎn)稱“FITC”。是一種小分子熒光素，其效率取決于于溶液的pH值，因此，在使用FITC時(shí)應(yīng)注意溶液的酸堿度。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490～495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。
FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用*泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。
2、藻紅蛋白，簡(jiǎn)稱“PE”。相對(duì)分子質(zhì)量較大，約為240kD，最大吸收峰為564nm，當(dāng)使用488nm激光激發(fā)時(shí)其發(fā)射熒光峰值約為576nm，故可能會(huì)對(duì)其它大探針產(chǎn)生空間位阻。
但PE的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，有很高的熒光效率，并易與抗體分子結(jié)合。需要注意的是PE作為天然染料，因來(lái)源不同可能造成熒光素結(jié)構(gòu)上的微小差別，導(dǎo)致其特征的不一致。
3、PI和EB。兩者都具有嵌入到雙鏈DNA和RNA的堿基對(duì)中并與堿基對(duì)結(jié)合的特異性。為了獲得特異的DNA分布，染色前必須用RNA酶處理細(xì)胞，排除雙鏈RNA的干擾。
PI和EB不能進(jìn)入完整的細(xì)胞膜，因此，又可以用于檢測(cè)死活細(xì)胞。PI和EB各種理化性質(zhì)相似，但PI比EB的發(fā)射光光譜峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，因而在做DNA和蛋白質(zhì)雙參數(shù)測(cè)量時(shí)，PI的紅色熒光和FITC的綠色熒光更易于區(qū)分和測(cè)量。另外，PI比EB測(cè)得的DNA分布的變異系統(tǒng)（CV值）低，所以PI得到更廣泛的應(yīng)用。
4、其它熒光素
單激光束三色熒光分析時(shí)，要求單激光激發(fā)，所選擇的三種熒光素的發(fā)射光波長(zhǎng)應(yīng)該有所不同。除FITC（發(fā)射綠光）、PE（發(fā)射橙光）外，還應(yīng)選擇發(fā)射紅光或深紅光的藻紅蛋白－花青素（phycoerythrin and cyanidinPC5)、葉綠素蛋白（peridinin chorophyll protein，PerCP）或藻紅蛋白－德克薩斯紅（phycoerythrin and Texas Red tandem，ECD）。因?yàn)檫@些熒光素在受到488nm的藍(lán)光激發(fā)后，均發(fā)射出紅色光或深紅色的發(fā)射光。
?。?）PC5和ECD是由在空間結(jié)構(gòu)上互補(bǔ)的兩個(gè)熒光素分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合而成，組成一個(gè)熒光分子。PC5由PE和cyanidin 5組成，ECD由PE和Texas Red組成。他們前一個(gè)分子的發(fā)射光波譜與后一個(gè)分子的激發(fā)光波譜相重合，這樣，當(dāng)前一個(gè)分子受激光激發(fā)后，產(chǎn)生的發(fā)射光可直接激發(fā)后一個(gè)分子，最后由后一個(gè)分子的發(fā)射光體現(xiàn)出整個(gè)組合的熒光特性。因此，此組成上說(shuō)是兩個(gè)分子，但表現(xiàn)為一個(gè)分子的物理性質(zhì)。
?。?）PerCP是從一種生活于深海區(qū)域的鞭毛蟲中發(fā)現(xiàn)的色素，其功能為將可滲透入深海的落光傳遞至鞭毛蟲的葉綠素發(fā)色基團(tuán)，進(jìn)而發(fā)出紅光。需注意的是PerCP為單個(gè)分子。
?。?）別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）和花青素5（cyanidin 5，Cy5）這兩種熒光素的激發(fā)光波長(zhǎng)要求在630nm左右，需第二根激光來(lái)激發(fā)。
